Leitfaden zur Proben vorbereitung für räumliche Transkript omik in Visium HD

So verarbeiten Sie frisches Gewebe ordnungs gemäß in FFPE-Blöcken

Formalin-fixierte Paraffin-Embedded (FFPE)-Proben werden häufig in der räumlichen Transkript omik verwendet, insbesondere in klinischen Umgebungen, in denen eine langfristige Gewebs konservierung unerlässlich ist. Für Studien mit dem10x Genomics Visium HD-PlattformHochwertige FFPE-Proben sind entscheidend für eine erfolgreiche nach geschaltete räumliche Gen expressions analyze. In diesem Artikel werden wichtige technische Überlegungen während der FFPE-Vorbereitung beschrieben, von der Fixierung bis zur Einbettung, um Forschern zu helfen, häufige Fallstricke zu vermeiden.

Schritt 1: Gewebes ammlung-Physische Schäden minimieren

Tipp 1:Gehen Sie während der Gewebe entfernung vorsichtig mit der Probe um, um mechanische Schäden zu vermeiden, die die Fixierung qualität beeinträchtigen können. Externer Druck kann führen zu:

• Ischämie

• Koagulative Nekrose durch Elektro kauter

• Blutung aufgrund eines chirurgischen Traumas

Tipp 2:Fixieren Sie das Gewebe so schnell wie möglich nach der Exzision. Wenn eine sofortige Fixierung nicht möglich ist (z. B. aufgrund einer längeren Blutung oder einer Verzögerung nach der Obduktion), lagern Sie die Probe vorübergehend in einer iso tonischen Lösung. Idealerweise sollte die Fixierung innerhalb beginnen4 StundenDer Gewebe entfernung, um Autolyse und RNA-Abbau zu vermeiden.

Schritt 2: Gewebe fixierung-Timing ist wichtig

Die Verwendung von 10% neutral gepuffertem Formalin oder 4% Para formaldehyd ist Standard. Beide haben jedochUnter fixierung und Über fixierungKann die räumliche transkript omische Leistung negativ beeinflussen.

Risiken der Unter fixierung:

• Rest enzymatische Aktivität, die zum Abbau von Proteinen, RNA und Lipiden führt

• Morpho logische Artefakte wie Chromatin verzerrung oder übermäßige zytoplasma tische Eosin färbung

• Autolyse-und Gewebe trennungs artefakte

Risiken der Über fixierung:

• Übermäßige Vernetzung, Lipid oxidation oder Verlust der Antigen ität

• Gewebe härtung, die das Abschneiden erschwert

• Morpho logische Verzerrungen einschl ießlich Zell schrumpfung oder nukleare Überfärbung

Empfohlener Ansatz:

Betrachten Sie vor der Fixierung dieArt, Gewebe typ und Krankheits modell. Während der Fixierung, stellen Sie sicher:

• Richtige Reagenz penetration

• Zeit gesteuerte Verarbeitung

• Vermeidung einer längeren Lagerung in Fixier mitteln

Schritt 3: Dehydration, Clearing und Paraffin infiltration

Eine schlechte Verarbeitung in diesem Stadium kann die RNA-Integrität und Schnitt qualität direkt beeinflussen.

Dehydration:

Ersetzen Sie nach und nach Restwasser im Gewebe durch abgestufte Konzentrationen durch Ethanol. Eine unvollständige Dehydration kann die Gewebes truktur beeinträchtigen und zu einer schlechten Morphologie führen.

Clearing:

Ethanol wird unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels (z. B. Xylol) entfernt. Eine unzureichende Reinigung kann die Infiltration von Wachs behindern und zu spröden Blöcken führen, die schwer abzuschneiden sind.

Paraffin infiltration:

Nach dem Löschen werden die Gewebe in geschmolzenes Paraffin wachs (60-62 °C) eingetaucht. UnvollständigInfiltration kann Hohlräume und Luftspalte im Block verursachen. Lassen Sie das Wachs nach der Infiltration zur Einbettung auf 20 ° C abkühlen.

Tipp:Verwenden Sie hochwertiges, niedrig schmelzendes Paraffin und überwachen Sie regelmäßig die Wachs temperatur, um eine Überhitzung zu vermeiden.

Schritt 4: Einbettung und Orientierung

Einbetten des Gewebes in Paraffin blöcke unter Beibehaltung der anatomischen Ausrichtung für genaue Abwärts schnitte.

Tipp:Dokumentieren Sie die Gewebe orientierung während der Einbettung eindeutig, um eine korrekte Ausrichtung während des Abschnitts sicher zustellen.

Best Practices für die Proben behandlung

• Aktualisieren Sie die Reagenzien regelmäßig, um eine Kontamination oder Über fixierung zu vermeiden.

• Lagern Sie Proben nicht über einen längeren Zeitraum in Fixier mitteln.

• Führen Sie Dehydration, Clearing, Infiltration und Einbettung ohne lange Verzögerungen nacheinander durch.

• Wenn keine sofortige Dehydrat isierung möglich ist, übertragen Sie das Gewebe zur kurzfristigen Lagerung auf 70% Ethanol.

• Speichern Sie Paraffin blöcke bei4 °CIn einer trockenen Umgebung, um Integrität zu bewahren. Vermeiden Sie Hitze und Feuchtigkeit.

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** Gutschrift: Alle in diesem Artikel vorgestellten Zahlen werden 10x Genomics gut geschrieben, sofern nicht anders angegeben.